Teràpia gènica per a EBS i RDEB (2022)

Malgrat la dificultat per obtenir mostres de pell durant el període de restriccions de Covid, els investigadors van demostrar que el seu tractament podria permetre que el canvi genètic que fa que es perdi RDEB ('exon skipping') tant a la pell com a les cèl·lules d'un plat. La injecció del tractament a les mostres de pell sobrants dels procediments quirúrgics, va donar lloc a un nivell baix però detectable de salt d'exons en el pas abans que es produeixi la proteïna de col·lagen. Els investigadors suggereixen que caldria treballar més per demostrar si això va permetre fer prou proteïna de col·lagen que funcionés per reduir els símptomes de RDEB.

L'ús de petits trossos d'àcid nucleic (com l'ADN) per ajudar a fer que la proteïna de col·lagen i queratina funcioni a partir de gens RDEB o EBS trencats ha mostrat una certa promesa a les cèl·lules. Ha estat més difícil mostrar els efectes a la pell on aquests petits trossos d'àcid nucleic terapèutic semblen funcionar de manera diferent. Els investigadors van publicar a revisar del progrés en aquest àmbit el 2021. 

Aquest projecte s'ha basat en el treball que els investigadors van publicar el 2019:

• Natural Exon Skipping estableix l'escenari per a Exon Skipping com a teràpia per a l'epidermolisi bullosa distròfica: Teràpia Molecular - Àcids Nucleics (cell.com)
• Teràpies per a l'epidermolisi bullosa: el lliurament és clau - Bremer - 2019 - British Journal of Dermatology - Wiley Online Library

Universitat de Dundee informar al projecte el 2019.

Investigadors principals:

Dra Robyn Hickerson és investigador principal de l'Escola de Ciències de la Vida amb un grup d'investigació actiu centrat principalment en el desenvolupament de terapèutiques per a trastorns genètics rares de la pell.
Dr Peter van den Akker, DEBRA Clinical Research Fellow, és un genetista clínic experimentat i ha centrat la seva carrera investigadora en teràpies basades en ARN per a RDEB i altres genodermatosis.

Co-investigador:

Dra Aileen Sandilands té una àmplia experiència des de 19 anys en el grup de trastorns genètics de la pell i desenvolupament de sistemes de salt d'exons amb l'objectiu de tractar trastorns genètics de la pell.

"El nostre objectiu final és desenvolupar terapèutiques per a totes les formes d'EB... A partir dels resultats emocionants i encoratjadors del nostre treball anterior, ara tenim previst optimitzar l'eficiència de salt d'exons en els nostres models de pell humana ex vivo i in vivo, per tal d'apropar-nos més. a un assaig clínic”

Robyn Hickerson i Peter Van den Akker

Títol de la subvenció: Desenvolupament d'una nova tecnologia gènica per al tractament de l'epidermòlisi bullosa simple (EBS) i l'epidermolisi bullosa distròfica recessiva (RDEB)

Al voltant del 70% dels casos d'epidermolisi bullosa (EB) es classifiquen com a EB simplex (EBS), que és causada per mutacions (errors) en els gens que fabriquen proteïnes anomenades queratina 5 i queratina 14 (KRT5 i KRT14). Les queratines són vitals per garantir una pell forta i sana. No hi ha tractaments efectius per a l'EBS, que es caracteritza per una ampolla persistent i una mala cicatrització de la pell tant interna com externament. Els gens s'hereten, una còpia de cada progenitor. Només una còpia del gen ha de contenir una mutació per provocar EBS: aquests s'anomenen gens dominants. En suprimir selectivament l'expressió de la còpia defectuosa del gen, això permet que la còpia normal del gen funcioni correctament, una estratègia que es creu que es podria desenvolupar en una teràpia adequada per a l'EBS.
L'objectiu inicial d'aquest projecte era desenvolupar una nova tecnologia per al silenciament gènic terapèutic a l'EBS. Quan es llegeix la seqüència genètica o d'ADN d'un gen, semblant a una recepta, finalment es tradueix a través d'una etapa intermèdia (ARN missatger) a la producció de proteïnes, en aquest cas les queratines que es troben a la capa superior de la pell, la epidermis. Els nous desenvolupaments en la tecnologia gènica fan que ara és possible sintetitzar un petit tros d'àcid nucleic que s'unirà a l'ARN missatger i l'inactivarà. Això s'anomena tecnologia de silenciament gènic. Els oligonucleòtids antisentit (ASO) són petites peces d'àcid nucleic que es poden dissenyar per unir-se específicament a còpies d'ARN missatger d'un determinat gen per destruir-les.

El Clinical Research Fellow va tenir l'encàrrec de desenvolupar aquesta nova tecnologia de silenciament gènic fins al punt que es pogués portar a la clínica. L'equip de Dundee ha estat treballant amb la companyia farmacèutica WAVE Ciències de la vida en aquest projecte i han identificat diversos ASO que poden silenciar l'ARN missatger KRT14 en cèl·lules de la pell humana cultivades al laboratori.

L'ús d'ASO per a l'epidermolisi bullosa distròfica recessiva (una forma més severa d'EB) és igualment difícil. L'epidermòlisi bullosa distròfica recessiva (RDEB) és causada per defectes en el gen COL7A1, la recepta genètica de la proteïna col·lagen tipus 7. Tothom porta dues còpies de COL7A1, però, a diferència de l'EBS, cal que hi hagi una mutació en ambdues còpies del col·lagen. gen per mostrar els símptomes de RDEB: aquests són gens recessius. L'enfocament per destruir l'ARN missatger defectuós no funcionarà aquí. Tanmateix, es pot utilitzar una classe diferent d'ASO que pot enganyar les cèl·lules perquè eliminin la part de l'ARN missatger on es troba la mutació. Aquest enfocament s'anomena "salto d'exons" i tot i que això donarà lloc a un ARN missatger una mica més curt, encara es pot utilitzar per produir col·lagen de tipus 7 actiu (però més curt). En un estudi de literatura, el Fellow va trobar que les persones en les quals el salt d'exons es produeix de manera natural (sense l'ús d'ASO, sinó a causa d'una variació addicional de l'ADN) encara tenen una forma de DEB, però això és més lleu de l'habitual. Això emfatitza que el salt d'exons és una estratègia terapèutica prometedora. L'equip de Dundee ha dissenyat diversos ASO que poden induir el salt d'exons de COL7A1 a les cèl·lules de la pell humana cultivades al laboratori.

Nova tecnologia antisentit per a EB: optimització del salt d'exons a la pell humana (Clinical Research Fellowship Any 5).

Els pacients amb el trastorn genètic de la pell epidermòlisi bullosa distròfica recessiva (RDEB) pateixen una pell extremadament fràgil perquè falta una proteïna clau (col·lagen 7) que manté les capes de la pell juntes. En pacients amb RDEB, les faltes d'ortografia ("mutacions") en el gen que codifica la proteïna del col·lagen 7 impedeixen que el cos la faci. A la Universitat de Dundee, estem intentant evitar els errors ortogràfics del gen del col·lagen 7 orientant-nos al pas que es produeix abans que es faci la proteïna. Abans de fer la proteïna del col·lagen 7, el gen fa una còpia portàtil de si mateix, aquesta còpia s'anomena ARN missatger i s'utilitza com a plantilla per fer la proteïna. En pacients amb RDEB, la còpia de l'ARN missatger conté els mateixos errors ortogràfics que el gen del col·lagen 7. La nostra estratègia és eliminar una petita part de l'ARN missatger que conté les faltes d'ortografia. Aquest enfocament es coneix com a "salt d'exons". Tot i que l'ARN missatger serà una mica més curt del normal, encara es pot utilitzar per fer la proteïna del col·lagen 7. Per descomptat, aquesta proteïna també serà una mica més curta del normal, però això encara és millor que no tenir cap proteïna de col·lagen 7.
El salt d'exons utilitza petites molècules anomenades oligonucleòtids antisentit (ASO) que s'adhereixen a la còpia de l'ARN missatger del gen del col·lagen 7 i enganyen les cèl·lules perquè eliminen la part on es troben els errors ortogràfics. Hem dissenyat diversos ASO i hem demostrat que són actius per saltar l'exó quan s'afegeixen a cèl·lules de la pell humana cultivades al laboratori. També hem pogut demostrar que els ASO són ​​actius en la pell humana real (pell de residus quirúrgics). Tanmateix, la quantitat de salt d'exons que podem detectar a la pell és baixa i els ASO semblen funcionar de manera lleugerament diferent a la pell en comparació amb les cèl·lules cultivades al laboratori.
Durant l'últim any hem estat optimitzant un mètode que ens permet fer un seguiment de la manera com es distribueix un ASO quan s'injecta a la pell humana. Aquest mètode ens va ensenyar que un ASO que s'injectava a la pell humana, efectivament, viatjava des de la dermis (la capa profunda de la pell on s'injectava l'ASO) fins a les cèl·lules de l'epidermis (la capa superior de la pell), on es saltava l'exó. ha de tenir lloc. Aquest resultat ens va convèncer encara més que el tractament amb ASO pot induir el salt d'exons a la pell humana real. Un cop més, aquest va ser un resultat encoratjador. Tanmateix, la quantitat de salt d'exons que vam detectar a la pell era baixa i els ASO semblen funcionar de manera lleugerament diferent a la pell en comparació amb les cèl·lules cultivades al laboratori. Per tant, ara estem centrats a fer que el salt d'exons a la pell sigui més eficient.
L'any passat també hem dissenyat i provat 37 nous ASO contra l'exó 13 a les cèl·lules de la pell per veure si podem identificar un ASO que funcioni encara millor que els que utilitzem actualment. També hem dissenyat 33 ASO nous contra l'exó 15 per fer proves de la mateixa manera. Els resultats preliminars han identificat diversos ASO que mostren activitat de salt de l'exó 13 i, per tant, s'investigaran més. (A partir de l'informe de progrés del 2022.)

Nova tecnologia antisentit per a EB: avançant el salt d'exons a la pell humana (Anys 3-4).

L'objectiu principal ara és estudiar si els ASO funcionals poden induir el salt d'exons del gen COL7A1 i el silenciament de la còpia d'ARN KRT14 mutant quan s'apliquen a la pell humana (utilitzant la pell sobrant dels procediments quirúrgics). Això implica estudiar maneres de lliurar aquests ASO a la ubicació correcta de la pell. Per tant, el becari està treballant estretament amb l'equip del doctor Hickerson.
Els objectius principals de la beca d'investigació clínica per avançar són:
• Induir el “knockdown” de l'ARNm KRT14 mutant per tractar l'EBS (per treballar en l'eliminació de l'ARN missatger de queratina que porta la mutació).
• Saltar els exons que contenen mutacions en el gen COL7A1 per tractar RDEB (per enganyar les cèl·lules del cos perquè eliminin o no llegeixin la part del gen on es troba la mutació).

Els pacients amb el trastorn genètic de la pell epidermòlisi bullosa distròfica recessiva (RDEB) pateixen una pell extremadament fràgil perquè falta una proteïna clau (col·lagen 7) que manté les capes de la pell juntes. En pacients amb RDEB, les faltes d'ortografia ("mutacions") en el gen que codifica la proteïna del col·lagen 7 impedeixen que el cos la faci.

Durant aquest projecte hem estat tractant d'enganyar les cèl·lules per evitar els errors ortogràfics del gen del col·lagen 7. Per fer-ho, ens hem fixat en un pas important que es produeix abans que es produeixi una proteïna. Un gen ha de fer una còpia portàtil de si mateix primer, aquesta còpia s'anomena ARN missatger i és utilitzada per les cèl·lules com a plantilla per fer la proteïna. En pacients amb RDEB, la còpia de l'ARN missatger conté els mateixos errors ortogràfics que el gen del col·lagen 7. La nostra estratègia és editar la petita part de l'ARN missatger que conté l'error ortogràfic. A aquest enfocament anomenem "salt d'exons". Editant l'ARN missatger d'aquesta manera i desfer-se de l'error ortogràfic, les cèl·lules ara poden produir la proteïna del col·lagen 7. Per descomptat, aquesta proteïna serà una mica més curta del normal, però això encara és millor que no tenir cap proteïna de col·lagen 7.

El salt d'exons utilitza petites molècules anomenades oligonucleòtids antisentit (ASO), aquestes s'adhereixen a la còpia de l'ARN missatger del gen del col·lagen 7 i enganyen les cèl·lules perquè eliminen la part que conté l'error ortogràfic. Hem dissenyat diversos ASO i hem demostrat que són capaços de provocar salts d'exons quan tractem cèl·lules de la pell humana cultivades al laboratori. També hem provat de tractar cèl·lules de la pell d'un pacient RDEB amb els nostres ASO i sembla que funcionen de la mateixa manera. També podem detectar la proteïna del col·lagen 7 en aquestes cèl·lules després de tractar-les amb els ASO, la qual cosa ens indica que els ASO funcionen com es pretén.

Una part important del projecte s'ha dedicat a esbrinar si els ASO funcionen a la pell humana. El nostre objectiu final és utilitzar els ASO per tractar pacients, de manera que és important saber si són actius a la pell i no només a les cèl·lules d'un plat. Abans de poder començar aquest treball, vam haver de desenvolupar mètodes de detecció altament sensibles per recollir el salt d'exons perquè aquestes eines de recerca no existien comercialment. Per als experiments amb la pell, vam injectar els ASO a les restes de pell sana dels procediments quirúrgics i després vam analitzar la pell per saltar-se els exons. Hem trobat que els ASO poden provocar un salt d'exons a la pell humana, cosa que és, per descomptat, un resultat extremadament encoratjador. Tanmateix, el principal repte que ens enfrontem és que la quantitat de salt d'exons que podem detectar a la pell és baixa. Els ASO també semblen funcionar de manera lleugerament diferent a la pell en comparació amb les cèl·lules cultivades al laboratori. És cert que no sabem si el nivell de salt d'exons que veiem a la pell és suficient per ser beneficiós per als pacients (només un assaig clínic donaria una resposta definitiva), però creiem que encara hi ha marge de millora. Per tant, a la part final del projecte ens vam concentrar en maneres d'augmentar la quantitat de salt d'exons a la pell. Hem dissenyat un nou conjunt d'ASO per intentar identificar-ne un que funcioni encara millor que els que utilitzem actualment, i també hem provat de barrejar els ASO amb un reactiu dissenyat per facilitar l'absorció dels ASO a les cèl·lules després d'injectar-los. la pell.

En general, aquest projecte ha demostrat que és possible utilitzar ASO per induir el salt d'exons a la pell humana real. L'optimització dels ASO i les millores en la manera com s'introdueixen a la pell seran necessàries per reforçar els seus efectes. Si es poden superar aquests obstacles, el salt d'exons com a tractament per a RDEB segueix sent una opció viable. (A partir de l'informe final de 2022.)