CRISPR/Cas9 per reparar el gen DEB (2025)

Aquest projecte d'un any va proporcionar proves preliminars per utilitzar un mètode de teràpia gènica CRISPR/Cas9 anomenat reparació dirigida per homologia (HDR) per tractar l'EB. Els investigadors van utilitzar HDR en cèl·lules extretes de biòpsies de pell de cinc persones amb EB distròfica. El seu procés va lliurar les molècules d'edició de gens a les cèl·lules del laboratori mitjançant un pols d'electricitat (electroporació) en lloc de virus modificats (vectors virals). Van descobrir que podien corregir els canvis genètics de manera eficaç en dos casos, fins a cert punt en un, i en els altres dos no era efectiu. Aquest treball va demostrar que l'HDR es podria utilitzar potencialment en la teràpia gènica EB, però s'hauria d'optimitzar per a cada pacient individualment.

El progrés del projecte s'ha presentat al Congrés Col·laboratiu ESGCT/SITGEC (Roma, Itàlia) del 22 al 25 d'octubre de 2024. Cartell número P1008. Veure cartell.

A la meitat del projecte, els investigadors informen que han assolit amb èxit la meitat de les seves fites. Els seus "pegats" genètics funcionen de manera més eficient del que s'esperava, però són més petits. Això vol dir que en necessitaran més i es centraran en això durant la segona meitat del projecte.

Investigador principal: El doctor Sergio López-Manzaneda és investigador del CIEMAT amb una sòlida formació en edició del genoma.

Co-investigadors: El doctor Fernando Larcher és professor associat de bioquímica a la Universidad Carlos III de Madrid i cap de divisió del CIEMAT (Divisió de Biomedicina Epitelial).

Alex Bassons Bascuñana és estudiant de doctorat del Grup de Biomedicina Epitelial de la Unitat d'Innovació Biomèdica del CIEMAT.

Col·laboració: La doctora Paula Rio és una experta reconeguda internacionalment en edició gènica i teràpia gènica de malalties hematopoètiques hereditàries, des de la ciència bàsica fins als assaigs clínics.

"Aquest enfocament d'edició de gens no vírics busca una estratègia universal i de baix cost per generar una biblioteca d'eines capaços d'abordar totes les mutacions conegudes... En futurs estudis preclínics, s'utilitzaran queratinòcits i fibroblasts editats amb gens "pegats" dels pacients. per generar equivalents de pell amb bioenginyeria".

– Dr Sergio López-Manzaneda

Títol de la subvenció: pegat d'edició del genoma no viral de COL7A1.

En aquest projecte, proposem una estratègia d'edició del genoma centrada en el tractament no només d'una mutació puntual sinó de grups de mutacions veïnes que causen RDEB, mitjançant la reparació d'exons complets que els alberguen. Aquest "pegat genètic" es basa en el mecanisme natural de reparació de l'ADN de recombinació homòloga (HR) facilitat pel sistema CRISPR/Cas9. Els "pegats" representen plantilles d'ADN donant HDR de doble cadena petites (300-400 parells de bases) que es dissenyarien a partir de seqüències gèniques suficients per cobrir pocs exons contigus, en aquest cas, corresponents al gen COL7A1 que codifica el col·lagen de tipus VII. El nostre objectiu és caracteritzar (eficàcia, seguretat) i estandarditzar l'ús d'aquesta tecnologia amb la idea de disposar de pegats específics fàcilment disponibles per fer front a grups individuals de mutacions. La tecnologia no viral proposada per al tractament amb cèl·lules de pacients RDEB ex vivo facilitarà la seva translació a la clínica a baix cost.

Un dels enfocaments terapèutics més prometedors per a l'EB és l'edició del genoma mitjançant tecnologies CRISPR/Cas9. Durant els últims 7 anys, el nostre laboratori ha estat treballant activament en aquest camp proporcionant dades sòlides de prova de concepte amb l'objectiu de traduir els seus resultats a la clínica. Mentre estem a les portes de l'aplicació clínica amb un d'aquests enfocaments que va obtenir una designació de medicament orfe per l'Agència Europea de Medicaments (EU/3/20/2253), continuem buscant estratègies d'edició del genoma més eficients, segures i clínicament rellevants.

En aquest projecte, proposem provar un enfocament innovador d'edició de gens que no requereixi l'ús de vectors virals (tot el material s'introdueix mitjançant una sola electroporació). L'objectiu és utilitzar aquests "pegats genètics" per corregir les regions mutades després d'haver tallat aquesta regió genètica amb la tecnologia CRISPR/Cas9. Hem dissenyat quatre "pegats" diferents, és a dir, plantilles de donant dsDNA modificades específicament en els seus extrems per una tecnologia propietària del nostre proveïdor (Integrated DNA technologies, IDT) per afavorir l'HDR. Aquestes plantilles contenen dos exons i el seu entorn (73 i 80, dos "pegats" cadascun) i quatre punts de tall diferents (dos per a l'exó 73 i dos per a l'exó 80). Aquestes plantilles (al voltant de 300-400 pb) també cobreixen els exons veïns.

Pretenem avaluar l'abast de la reparació dins dels "pegats" que ens permetria abordar grups de mutacions o, si el sistema funciona prou bé, corregir completament els exons dins dels "pegats". Creiem que aquesta novel·la estratègia d'edició genètica personalitzada, sense viral, es podria traduir fàcilment a la clínica amb un cost econòmic significatiu i baix.

Hem assolit amb èxit la meitat de les fites de la subvenció. Inicialment, la nostra estratègia tenia com a objectiu reescriure el genoma mitjançant "pegats" d'ADN per cobrir parells d'exons (orientant específicament a mutacions en parells d'exons: 72-73, 73-74, 79-80 i 80-81). Tanmateix, els pegats d'ADN que vam utilitzar van resultar ser lleugerament diferents del que esperàvem. Aquests pegats poden reescriure el genoma amb una eficiència superior al 80%, que és superior a la que s'havia informat anteriorment, però la seva acció es limita a una finestra estreta. Tenint en compte això, la nostra estratègia de fase 2 es centrarà ara en pegats d'ADN individuals per a cada exó. Per assegurar-nos que no modifiquem seqüències d'ADN saludables, el "tall molecular" CRISPR/Cas9 només s'orientarà a seqüències mutades. Això requerirà petits ARN específics per a cada mutació, mentre que es pot utilitzar un pegat d'ADN comú per a cada exó. (Informe de juliol de 2024).

Inicialment, la nostra estratègia tenia com a objectiu reescriure el genoma mitjançant "pegats" d'ADN per cobrir parells d'exons, orientant específicament a mutacions en parells d'exons 72-73, 73-74, 79-80 i 80-81. Tanmateix, els pegats d'ADN utilitzats difereixen lleugerament de les nostres expectatives. A diferència de les estratègies HDR clàssiques, aquest nou sistema IDT (Integrated DNA Technologies) no pot reescriure seqüències més enllà de 30 nucleòtids, limitant la seva acció a una finestra estreta.

Tenint en compte això, la nostra estratègia de fase 2 es va centrar en pegats d'ADN individuals per a cada exó. Per garantir que les seqüències d'ADN saludables romanen sense modificar, el "tall molecular" CRISPR/Cas9 només s'adreça a seqüències mutades. Això requeria petits ARN específics per a cada mutació, mentre que es podia utilitzar un pegat d'ADN comú per a cada exó. Vam reescriure amb èxit l'ADN amb una eficiència alta (>70%) en 2 de cada 5 mutacions (pacient 2 i pacient 73.4), vam aconseguir una eficiència moderada (>25%) en altres 2 (pacient 73.2 i pacient 2) i amb prou feines vam modificar una (5%) (E73.3). Tot i que la classificació de clons corregits és una estratègia factible, l'ús d'aquests clons per al trasplantament suposaria un repte tècnic en els assaigs clínics si es partissin de taxes d'eficàcia baixes. No obstant això, aquest treball proporciona almenys dues alternatives terapèutiques prometedores per a les mutacions c.6041_6042delAG i c.6100G>A, utilitzant un enfocament HDR no viral en lloc del sistema tradicional de lliurament de vectors virals. (A partir de l'informe final de març de 2025.)